O trabalho da defesa é evitar que o ataque marque pontos. Eles fazem isso abordando os jogadores que estão carregando a bola e forçando-os a cometer uma virada (fumble, interceptação ou virada nas descidas) ou chutar a bola para longe. Os 11 jogadores na defesa normalmente serão uma combinação de: atacantes defensivos; Linebackers; Laterais; Seguranças.
Os treinadores defensivos têm opções semelhantes quando se trata de qual combinação de jogadores eles querem em campo para uma determinada jogada. Uma defesa de “base” pode consistir em quatro atacantes defensivos, três linebackers, dois cornerbacks e dois safeties. O treinador pode optar por substituir alguns desses jogadores, no entanto. Os “subs” mais comuns vão com três atacantes defensivos e quatro linebackers, mas mantendo o secundário (os cornerbacks e safeties) o mesmo.
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Eles também podem substituir um linebacker por um cornerback extra. Equipes Especiais – As equipes especiais são responsáveis pelo jogo de chute. Isso inclui tentativas de chute de posição que tentam marcar pontos e punts que dão a bola para o outro time depois que o ataque não conseguiu uma primeira descida. Quando uma unidade está no pontapé inicial, a equipe de retorno do chute da outra equipe estará em campo. O mesmo vale para cada uma das outras três combinações.